Kan Dried Blood Spot

Kan Dried Blood Spots øke validiteten i kostholdforskning?

De færreste kostholdstudier har mulighet til å utnytte biomarkører i sin forskning. Økt bruk av Dried Blood Spots kan bidra til å øke antall studier med biologisk prøvemateriale. Utførelsen av prøven krever ikke helsepersonell, slik at deltagere i studier og liknende kan ta blodprøver på egenhånd.

Beate Østengen
Beate Østengen

Master i Samfunnsernæring

Biomarkører er et objektivt mål på inntak av visse matvarer, og kan tas fra vev, urin, plasma/serum eller blod

(1)
. Maten vi spiser består av makro- og mikronæringsstoffer, samt flere andre forbindelser av både spiselig og ikke-spiselig art hvor flere stoffer kan brukes i biologiske prøver. Biomarkører kan ikke kartlegge et fullt kosthold, men kan til en viss grad reflektere inntak av næringsstoffer og visse matvarer eller kostholdmønstre
(2)
. Siden markørene er objektive mål på næringsinntak, fungerer de godt som tillegg til kostholdsundersøkelser som matvarefrekvensskjemaer
(3)
. Utfordringen er i mange tilfeller at biologiske prøver er kostbart og bruken er ofte ikke levedyktig for mindre studier.

Dried Blood Spots (DBS) er derimot et rimeligere alternativ og kan utføres av deltageren selv, samtidig som det kan bidra til å lette arbeidet til forskeren.

Hva er DBS

For å ta en blodprøve med DBS trenger man lite materiell. Et typisk DBS-kit kan bestå av to fingerstikk lansetter, et filterpapir med fem sirkler (spots) på, engangs steriliseringsservietter, og en aluminiumpose til å oppbevare den ferdige prøven i. Prøven tas ved å rense fingeren, deretter stikke lansetten på siden av fingertuppen før du drypper blod ned i sirklene på filterpapiret. Den ferdige prøven tørkes i romtemperatur før den puttes i en aluminiumpose og sendes til analyse.

Tusenvis av metabolitter, næringsstoffer, peptider, proteiner, hormoner og andre kjemiske forbindelser kan bli analysert i små mengder full-blod ved bruk av DBS

(4)
. I Norge er VITAS Analytical Services i Oslo ansvarlig for analysene, som er en av de ledende aktørene i verden på sitt felt
(5)
. VITAS ble etablert i 1994 og den gang ble kun et fåtall fettløselige forbindelser analysert. I dag analyserer VITAS tusenvis av prøver ved hjelp av ulike analysemetoder som kromatografi. Tidligere ble DBS metoden kun brukt ved screening av nyfødte for Føllings sykdom i 1960 årene. I dag brukes metoden mer og mer i kvantitativ forskning
(5)
.

Fordeler og ulemper ved DBS

I tillegg til fordelene som er nevnt innledningsvis trenger ikke DBS utføres av autorisert helsepersonell

(5)
, og det kreves bare en liten mengde prøvemateriale. I tillegg er det ofte mindre påkjenning for deltageren forbundet med prøvetaking. Andre fordeler ved DBS er at den kan utføres hjemme hos deltagerne, i et klasserom, hos en ernæringsfysiolog, i apotek, før, under og etter arrangementer, eller ute i felten
(5)
. Et DBS-kit kan også sendes til deltageren i en studie via posten, og den ferdige DBS-prøven kan returneres i en lukket aluminiums-pose som får plass i en 10x15 cm konvolutt. På den måten kan DBS være et godt alternativ hvor prøvematerialet skal samles inn over et bredt geografisk området. Avhengig av hva som skal analyseres, så er det ofte heller ikke nødvendig at personen er fastende når prøven tas.

Samtidig er det enkelte utfordringer assosiert med bruk av DBS. Fullblod har flere ulike egenskaper kan forårsake utfordringer ved analyser av biomarkører sammenliknet med plasma og serum

(4)
. Det finnes videre mindre informasjon om metabolitter i fullblod sammenliknet med prøver tatt fra plasma eller serum, og validering av biomarkører og analyser er nødvending for valide resultater i en ernæringsepidemiologisk sammenheng. Siden prøvene kan utføres av omtrent hvem som helst, vil kvaliteten på prøvene variere utfra om korrekt prosedyre følges eller ikke
(4)
. En utfordring ved bruk av filterpapir, er at området hvor blodet skal dryppes kun er 13 mm i diameter og blodet bør dekke så mye som mulig av feltet. Et standard DBS-kit inneholder ofte kun to fingerstikk lansetter, noe som kan være utilstrekkelig dersom to stikk ikke er nok for å få ønsket mengde prøvemateriale.

På samme måte som ved andre blodprøver, vil biologiske variasjoner i biomarkørene mellom individer også forekomme som forskjeller i absorbsjon og metabolisme. I tillegg til at alder, kjønn, sykdom og medisinbruk også kan påvirke prøveresultatet I tillegg vil en DBS-prøve der for eksempel fettsyrer analyseres, kun gi et bilde på en dag-til-dag variasjon av innholdet av fettsyrer i kostholdet, og ved studier der kartlegging av langtidsinntaket er hovedmål, må andre metoder benyttes.

Analyse av fettsyrer i kostholdforskning

Fettsyrer kan reflektere ulike kostholdmønstre som enten er preget av høyt eller lavt fettinntak, men også et kosthold preget av mer eller mindre vegetarisk sammenliknet med et kjøttetende kosthold

(6)
. Flerumettede fettsyrer som omega-3-fettsyrer har ofte blitt brukt i kartleggingen av inntaket av fet fisk
(7)
. Forskning viser også at de mettede fettsyrene pentadecyclic syre (C:15) og margarinsyre (C:17) kan gi indikasjoner på inntak av melk og meieriprodukter (
2
,
6
,
8
). Den randomiserte kliniske studien Food4Me
(6)
undersøkte inntaket av melk og meieriprodukter blant 1471 deltagere fra Tyskland, Hellas, Irland, Nederland, Polen, Spania og Storbritannia. De brukte C15:0 og C17:0 som biomarkører ved bruk av DBS. Resultatene viste at C:15 kunne være en passende biomarkør for inntak av fete meieriprodukter, men verken C:15 eller C:17 var gode indikatorer på totalt inntak av meieriprodukter
(6)
.

image

Et typisk DBS-kit kan bestå av to fingerstikk lansetter, et filterpapir med fem sirkler (spots) på, engangs steriliseringsservietter, og en aluminiumpose til å oppbevare den ferdige prøven i.

Foto: Beate Østengen

En bioindeks er navn på en blodprøve tatt med DBS som brukes i ernæringsforskning

(9)
. Her er det særlig fokus på omega-3-fettsyrer, vitamin D samt andre kostkomponenter. De mettede fettsyrene laurinsyre (C12:0), myristinsyre (C14:0) og palmitinsyre (C16:0) er som kjent de mest potente til å påvirke LDL-kolesterolet (
10
,
11
) og kan sammen med en rekke andre fettsyrer analyseres ved DBS. I kostholdforskning kan det være svært interessant å tolke resultater fra fettsyre-profilen i sammenheng med resultater av kolesterolmålinger og kostholdsundersøkelser. Innsamling av fettsyrer ved hjelp av DBS i kostholdforskning må imidlertid utføres nøyaktig fordi noen fettsyrer som kjent kan påvirkes av forhold som lys, matinntak og temperatur.

Oppbevaring av prøvene

Det er velkjent at fettsyrer, særlig de flerumettede fettsyrene, kan endres ved blant annet temperaturendringer og lyspåvirkning. Ved bruk av DBS er anbefalt prosedyre ved lagring av prøvene: «luft tørking i romtemperatur i 4-5 timer etter at prøven er tatt, for videre å bli bevart i fryser ved -20 grader celsius» (

4
,
12
). Prøvene kan bli oppbevart i 14 dager ved denne temperaturen
(13)
, men noen faktorer vil ha innvirkning på kvaliteten av prøvematerialet som type fettsyrer og type filterpapir.

Større kliniske studier kan imidlertid møte utfordringer ved oppbevaring av prøvene ved feltarbeid i varmere klima. Det er særlig de langkjedede flerumettede fettsyrene (20 karboner) og (3 karbon-karbon dobbeltbindinger), som er utsatt for oksidering ved temperaturendringer

(13)
. Filterpapiret hvor bloddråpene blir påført er imidlertid impregnert med antioksidanter for å unngå oksidering av de lang-kjedede fettsyrene
(14)
. Forskning viser også at ikke bare ytre faktorer påvirker fettsyrene, men også jern som finnes naturlig i de røde blodcellene kan i seg selv påvirke oksideringsprosessen
(14)
. Metherel og hans kollegaer
(13)
fant ut at degraderingen av de langkjedede fettsyrene ble redusert når filterpapiret var impregnert med chelatorer som forhindrer oksidering fra jern ved oppbevaring opptil 14 dager, men ved -20°C. Optimalt skal prøvene oppbevares kaldere, men små frysere til kommersiell bruk er ofte ikke kaldere enn dette
(13)
. Innen kostholdforskning er kolesterolet en sentral faktor fordi et høyt kolesterol har svært negative helseeffekter
(15)
. Ved forskning på kolesterol og mettede fettsyrer vil derimot ikke utfordringer vedrørende degradering være tilstede.

Veien videre

DBS kan også bidra til mer personlige formål. Populariteten rundt selvtesting har økt, og det jobbes i dag med å få til analyser av blant annet metthetshormoner fra enkeltpersoner. Trolig vil også enkeltpersoners respons på et måltid målt utfra kurver av glukose, insulin, triglyserider, C-peptid og aminosyrer bli analyser vi vil kunne vurdere i fremtiden.

Så er spørsmålet om DBS kan heve kvaliteten ved kostholdforskning. Siden det ikke finnes noen «gullstandard» på hva folk egentlig spiser, har ofte bruken av biomarkører i sammenheng med for eksempel matvarefrekvensskjema blitt sett på som det nærmeste man kommer en gullstandard

(1)
. Biomarkørene stammer ofte fra plasma/serum og vil derfor utelate mindre studier på grunn av økonomiske spørsmål. Dersom DBS kan bidra til å øke antall studier som tar i bruk biomarkører er det en forutsetning med velprøvde metoder og analyser som er validert, samtidig som biomarkører til ulikt bruk valideres. Når prosedyren ved DBS følges, og filterpapiret er impregnert med både antioksidanter og chelatorer, kan DBS vurderes som en trygg, enkel og relativt rimelig måte å samle biologiske prøver; spesielt blant en større geografisk populasjon. I fremtidig kostholdforskning vil muligens DBS prøver være avgjørende der biomarkører er essensielt, og samtidig muligens bidra til å heve kvaliteten på mindre studier. Imidlertid vil jeg igjen understreke nødvendigheten av å ha valide biomarkører og valide metoder før man tar det i bruk i videre forskning.

image

Prøven tas ved at lansetten stikkes på siden av en renset fingertupp før du drypper blod ned i sirklene på filterpapiret.

Foto: Beate Østengen

image

Ferdige prøve tørkes i romtemperatur før den puttes i en aluminiumpose og sendes til analyse.

Foto: Beate Østegen

Referanseliste

Willet W. Nutritional Epidemiology. 3rd ed. Oxford: Oxford University Press; 2013.

Brevik A Veierød MB, Drevon CA, Andersen LF. Evaluation of the odd fatty acids 15:0 and 17:0in serum and adipose tissue as markers of intake of milk and dairy fat. European Journal of Clinical Nutrition. 2005;59(12):1417.

Hjartåker A, Veierod MB. Ernæringsforskning. In: Laake P, Hjartåker A, Thelle DS, Veierød MB, editors. Epidemiologiske og kliniske forskningsmetoder. Oslo: Gyldendal Akademiske; 2007. p. 401-36.

Holen T, Norheim F, Gundersen TE, Mitry P, Linseisen J, Iversen PO, et al. Biomarkers for nutrient intake with focus on alternative sampling techniques. Genes & Nutrition. 2016;11(1).

Vitas Oslo. DRIED BLOOD SPOTS [Available from: http://vitas.no/services/dried-blood-spots. (09.08.2016).

Albani V, Celis-Morales C, Marsaux CF, Forster H, O’Donovan CB, Woolhead C, et al. Exploring the association of dairy product intake with the fatty acids C15:0 and C17:0 measured from dried blood spots in a multipopulation cohort: Findings from the Food4Me study. Molecular Nutrition & Food Research. 2016;60(4):834-45.

Andersen LF, Solvoll K, Drevon CA. Very-long-chain n-3 fatty acids as biomarkers for intake of fish and n-3 fatty acid concentrates. The American Journal of Clinical Nutrition. 1996;64(3).

Samuelson G, Bratteby L-E, Mohsen R, Vessby B. Dietary fat intake in healthy adolescents: inverse relationships between the estimated intake of saturated fatty acids and serum cholesterol. Br J Nutr. 2001;85(3):333-41.

Bioindex. Om bioindeksene 2008 [Available from: http://www.bioindex.no/OmBioindexene.php. (09.08.2016).

Helsedirektoratet. Anbefalinger om kosthold, ernæring og fysisk aktivitet. Oslo: 2014 IS-2170.

World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations. Diet, nutrition and the prevention of chronic diseases: Report of a Joint WHO/FAO Expert Consultation. Geneva: World Health Organization, 2003 WHO technical report series: 916.

Bastani NE, Gundersen TE, Blomhoff R. Dried blood spot (DBS) sample collection for determination of the oxidative stress biomarker 8-epi-PGF(2alpha) in humans using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2012;26(6):645-52.

Metherel AH, Stark KD. Cryopreservation Prevents Iron-Initiated Highly Unsaturated Fatty Acid Loss during Storage of Human Blood on Chromatography Paper at -20C. The Journal of Nutrition. 2015;145:654-60.

Marangoni F, Colombo C, Galli C. A method for the direct evaluation of the fatty acid status in a drop of blood from a fingertip in humans: applicability to nutritional and epidemiological studies. Anal Biochem. 2004;326(2):267-72.

Ridker PM. LDL cholesterol: controversies and future therapeutic directions. The Lancet. 2014;384(9943):607-17.